SF3B1稳态对T细胞白血病的生存和治疗反应至关重要

　　摘要非经典mRNA转录产物的产生与细胞转化有关。根据我们先前关于T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）对SF3B1抑制剂敏感性的研究结果，我们发现SF3B1抑制在体内可阻断T-ALL的生长，且无明显的相关毒性。我们还揭示了U2复合物组分SF3B1通过脱氮后的蛋白质稳定性。我们的研究表明，SF3B1抑制干扰外显子跳跃，导致无意义介导的衰变和DNA损伤反应相关转录物水平的降低，如丝氨酸/苏氨酸激酶支票2以及DNA损伤反应受损。我们还发现，抑制SF3B1会导致R环形成的普遍减少。进一步证明与临床上使用的抑制白血病生长的药物有协同作用。我们的研究为T细胞白血病中U2复合体的翻译后调控及其相关作用和治疗意义提供了理论依据。简介在高等真核生物中，选择性mRNA剪接影响95%以上的多外显子前mRNA(1)异常剪接是癌症的一个特征，也是癌症治疗的潜在靶点，它由异常表达水平和剪接因子突变决定，这些突变至少在50%的患者中可以发现(2)剪接异常是白血病早期剪接异常的一个重要环节(三–7)突变体SF3B1促进了变异分支点序列的使用，导致了隐性3′剪接位点的全局选择和MYC的稳定(8,9)最近有报道指出，SF3B1的突变会导致R环的积累，R环是一种含有一条DNA链和一个DNA/RNA杂交体的染色体结构，如果不进行修复，会导致DNA损伤的增加(10,11)此外，最近越来越多的研究表明剪接因子表达改变在癌症中的作用(12,13)大量研究表明，活性转录和剪接是功能耦合的(14–16)富含丝氨酸/精氨酸家族的剪接因子，如SRSF2，已被证明与转录机制的组成部分相互作用以介导转录激活(14,17)相反，延伸率、启动子的类型和转录相关因子已经被证明会影响选择性剪接(18,19)具有高水平转录因子和转录放大器MYC的肿瘤高度依赖于剪接调节，这意味着对剪接扰动的敏感性增加(20)一。T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种侵袭性疾病，约占15%的儿童和25%的成人ALL病例(21–26)标准大剂量化疗是T-ALL的现代一线治疗方法，治疗方案可持续3年。我们已经报道了T-ALL的表观遗传、转录和剪接改变的增加，因此是研究剪接和转录的合适模型(26,27)我们证明了异常的外显子跳跃会影响关键路径，如蛋白酶体途径，尽管T-ALL中几乎没有剪接因子突变(24,26,28)既往研究也表明，SF3B1对MDS、急性髓系白血病（AML）和慢性单核细胞白血病（CMML）的抑制作用已在临床上得到评估(29–31)阻断白血病细胞生长，对正常CD34的毒性相对较低+造血祖细胞(26)一。通过泛素特异性肽酶7（USP7）对T-ALL进行主动脱氮，发现SF3B1蛋白在T-ALL中高表达，抑制USP7活性可导致SF3B1降解。我们还发现，SF3B1抑制阻断了活性转录，导致R环的变化，并导致外显子跳过改变影响DNA修复转录，如支票2，导致转录物无意义介导的衰变（NMD）。抑制SF3B1增强化疗和CHEK2抑制剂的敏感性。我们的研究结果表明，依赖高SF3B1水平的白血病细胞可能是由于SF3B1除了剪接外，在控制癌基因转录方面的作用，从而导致其对高危癌症的耐药性产生影响。结果抑制SF3B1抑制白血病生长U2小核核糖核蛋白（snRNP）复合物是主要的化学靶向剪接复合物，由剪接因子3A/B家族成员（SF3A1、SF3A2、SF3A3、SF3B1、SF3B2、SF3B3、SF3B4、SF3B5、SF3B6、SF3B7和SF3B14）、植物同源域指状结构域因子5A（PHF5A）和SF1组成(32)我们已经证明了T-ALL细胞对剪接干扰的敏感性，包括SRSF6沉默和SF3B1抑制(26)我们已经证明SRSF6沉默导致外显子跳跃的扰动，影响蛋白酶体、细胞周期和RNA生物学相关转录。为了阐明SF3B1的功能作用以及T-ALL对剪接扰动敏感的相关机制，我们沉默了SF3B1在T-ALL细胞系中使用短发夹rna（shRNAs）。细胞增殖率明显降低SF3B1沉默(图1，A和B)伴随着凋亡细胞死亡和G2-M细胞周期阻滞（图S1，A和B）。T-ALL细胞株对E7107抑制剂敏感50（中值抑制浓度）纳摩尔范围内的浓度（图S1C），类似于所有诊断患者样本（图S1D）。用SF3B1抑制剂E7107处理也显示出2-M细胞周期停止和凋亡轻微增加（图S1，E到H）。为了进一步评估SF3B1在体内疾病进展中的作用，我们沉默了SF3B1表达荧光素酶的CUTL1细胞并将其移植到免疫功能低下的小鼠体内。SF3B1沉默能显著减轻肿瘤负担，延长小鼠存活时间(图1，C和D)我们进一步研究了化学抑制SF3B1活性是否能在体内抑制肿瘤生长。E7107治疗降低了疾病负担，并使患者的生存率提高(图1，E至G)在造血祖细胞中过度表达NOTCH1转录因子（NOTCH1-ΔE）的致癌截短等位基因的T-ALL独立小鼠模型的应用(33)，再加上移植到免疫受损小鼠受体中，E7107治疗也显示出肿瘤生长受到抑制，如脾脏缩小所示(图1H)我们先前的研究表明，SF3B1抑制作用对造血祖细胞如CD34的毒性降低+细胞(26)，我们目前的体内毒性分析未能检测到与体重或器官重量、血细胞数量、杯状细胞化生或其他胃肠道毒性相关的显著毒性，如先前用于阻断T-ALL治疗中NOTCH1活性的γ分泌酶抑制剂药物(图1，I和J，图S1I和表S1）(34)总之，我们的数据表明SF3B1的水平和活性对白血病细胞的存活至关重要。图1.SF3B1沉默或抑制阻断T细胞白血病的生长。(A)免疫印迹显示Cuttl1和JURKAT细胞中SF3B1的缺失。GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。(B)在指定的时间点对CUTLL1和JURKAT细胞进行计数，并绘制细胞生长图，如图所示shSF3B1#1-以及shSF3B1#2-表达细胞群(n=3）。(C)将表达荧光素酶的CUTL1细胞转化为控制或shSF3B1#2然后静脉注射（经眶后）到免疫受损小鼠体内。第8天和第24天代表性小鼠的发光分析（左）和第8天到第24天的发光强度倍数变化（右：控制,n=5；shSF3B1#2,n=6）。(D)（C）小鼠存活曲线分析*P≤0.05和**P≤0.01。(E)异种移植模型中的E7107治疗方案。(F)第10天开始静脉注射表达酶的小鼠（7天/kg），随后在小鼠尾静脉注射表达荧光素酶的细胞（第10天）。第10天和第20天代表性小鼠的发光图像（左）和第10天到第20天的发光强度倍数变化（右：车辆，n=9；E7107，n=9）。(G)（F）小鼠存活分析。(H)小鼠脾脏大小（左）和重量（右）E7107处理诺奇1-δE-樱桃+逆转录病毒T-ALL模型(n=3），E7107(n=5）]。(我)E7107治疗后的代表性小鼠体重、肝脏重量和脾脏重量分析。(J)食管、胃、空肠和回肠的典型苏木精和伊红染色（放大200倍）。SF3B1在T细胞白血病中被翻译后调控尽管普遍缺乏SF3B1突变，但T-ALL细胞对SF3B1抑制剂敏感(26)我们试图进一步研究T-ALL中SF3B1水平和遗传状态的变化。我们过去的研究和来自儿科癌症基因组计划的数据表明，与其他血液学和实体肿瘤相比，T-ALL的剪接体突变很少(26)为了评估U2家族成员在癌症中的重要性，我们分析了来自肿瘤依赖图项目（DepMap）的563个实体肿瘤和血液肿瘤细胞系的基因功能筛选和基因表达数据；https://depmap.org/portal/) (35)包含约560个细胞系，包括三个T-ALL细胞系（SUPT1、PF382和HSB2）。与其他癌症相比，U2家族成员对T-ALL的生存至关重要(图2A) (26)对癌细胞系百科全书（CCLE）库中U2家族mRNA表达水平的分析表明，SF3B1是T-ALL中U2家族成员中最高表达的成员之一（图S2，A和B）。然后我们检测了包括CD3在内的一组生理性T细胞亚群中SF3B1、SF3A3和PHF5A水平+，CD4+，和CD8+T细胞和7个T-ALL患者。与健康T淋巴细胞相比，人类患者和T-ALL小鼠模型的SF3B1蛋白水平显著高于正常T淋巴细胞(图2、B和C，以及图S2，C至E）。然后，我们比较了最具侵袭性的T-ALL背景（HR（高危）患者的SF3B1蛋白水平，这些患者要么复发，要么对化疗无反应。与非HR患者相比，HR患者的SF3B1蛋白水平（而非mRNA水平）更高，这表明SF3B1蛋白水平可能与治疗抵抗有关(图2D以及图S2F）。图2.SF3B1在T细胞白血病中被翻译后调控。(A)U2剪接复合物组分在不同类型癌症中的相对重要性。重要数据来源于阿基里斯CRISPR-Cas9项目筛选563个癌细胞系的数据集。(B)免疫印迹显示患者与T细胞中SF3B1蛋白水平的对比[蛋白质水平的量化见图S2D，（N1-IC，NOTCH1胞内结构域）]。(C)逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测人T-ALL与T细胞sf3b1mrna表达(n=3）*P≤0.05。(D)HR患者SF3B1蛋白水平的RPPA分析(n=17）与非人力资源(n=25）病例。(E)免疫印迹显示在用10μM PR619、2μM b-AP15或200 nM ML323（24小时）处理的Cuttl1和JURKAT细胞中SF3B1蛋白表达水平。GAPDH用作加载控制。(F)用10μM P5091处理CUTL1和JURKAT 24小时后的SF3B1蛋白水平。(G)USP7（左）和SF3B1（右）的典型共免疫沉淀分析，以评价USP7和SF3B1在Cuttl1细胞中的相互作用。免疫沉淀法；IgG，免疫球蛋白G(H)环己酰亚胺（CHX）（10μg/ml）处理后SF3B1蛋白表达的代表性免疫印迹控制-以及shUSP7型-表达RPMI-8402细胞12小时。蛋白质水平的定量显示（右图）。(我)用10μM P5091（24小时）处理细胞后SF3B1蛋白表达的典型免疫印迹。(J)免疫沉淀法结合免疫印迹法检测血凝素（HA）标记或HA-K63O（只有K63可泛素化）泛素（Ub）结构和Flag-SF3B1共转染293T细胞中SF3B1泛素化。我们和其他人最近证明了剪接体因子，如hnRNPA1和SRSF6，来自泛素样蛋白（UBLs）的修饰(26,36–38)USP7通过去蛋白化对剪接因子的翻译后调控有助于其在白血病中的高蛋白水平(26)为了研究USP7在控制SF3B1中的潜在作用，我们用全脱氧核糖核酸酶抑制剂PR619和USP7抑制剂P5091处理T-ALL细胞，并用抑制原癌性二肽酶USP1（ML323）和USP14/UCHL5（b-AP15）的化合物处理T-ALL细胞(39–43)与P5091和b-AP15类似，PR619抑制剂降低了SF3B1蛋白而不是mRNA水平(图2，E和F，以及图S2、G和H）。相比之下，使用影响MYC的JQ1抑制剂（一种已知的剪接基因转录调节器）的处理并没有导致SF3B1蛋白水平的变化（图S2I），这进一步表明SF3B1可能主要在T-ALL的翻译后水平进行调节。我们对SF3B1和这些双奎基酶之间的相互作用的评估表明，USP7，而不是USP14或UCHL5，与SF3B1相互作用(图2G以及图S2、J和K）。我们进一步研究了USP7与SF3B1的关系。我们的研究表明，在放线菌酰亚胺（CHX）处理下，USP7基因敲除降低了SF3B1蛋白水平，但对RPMI-8402和JURKAT细胞没有影响(图2H以及图S2L）。与CHX单一处理相比，SF3B1蛋白在CHX加P5091处理后的半衰期较短（图S2，M和N）。与细胞质中的SF3B1水平相比，USP7抑制尤其影响核SF3B1水平，这表明USP7在核SF3B1功能中起着关键作用（图S2O）。比较T-ALL和其他血液学（B-ALL和髓样亚型）和实体瘤（肺、乳腺、黑色素瘤和胰腺腺癌）中SF3B1和USP7蛋白水平的比较表明，与实体癌细胞相比，白血病细胞中SF3B1和USP7的水平相对较高（图S2P）。白血病中表达水平的增加与白血病样本中SF3B1水平对USP7抑制的敏感性增加有关(图2I以及图S2Q）。然后，我们分析了P5091治疗后SF3B1泛素化，以确定SF3B1多泛素化显著增加(图2J，左）。阻断多泛素链形成的泛素突变体的使用表明，在SF3B1上形成了K63连接的多泛素链，而不是K48连接的多泛素链(图2J图S2R）。总之，我们的发现表明SF3B1在翻译后水平上受到调控。DNA损伤反应转录本对SF3B1干扰敏感为了了解SF3B1在肿瘤生长中的作用，我们旨在描述SF3B1调控的剪接事件。我们通过临床上使用的转录抑制剂E710进行配对测序(29)然后将剪接事件分为跳过外显子（SE）、保留内含子（RI）、互斥外显子（MXE）、备选5′剪接位点（A5SS）和备选3′剪接位点（A3SS）。用E7107处理的细胞在15分钟时出现RI变化，随后在30分钟、1小时和24小时的SE事件出现峰值(图3A，图S3A和表S2）。这些剪接改变是药物剂量依赖性的（图S3B），并且与由SF3B1使用两个独立的shrna进行消声(shSF3B1)（图S3C和表S3）。与E7107处理相似，我们确定SE是沉默后的主要剪接变化SF3B1（图S3，C至E）。在SF3B1抑制和沉默之间通常交替剪接的转录本代表着最相关的SF3B1靶点，它们在DNA损伤反应（DDR）途径中富集(图3、B和C)用另一种临床使用的SF3B1抑制剂H3B-8800治疗，在剪接改变方面也表现出相似性shSF3B1（图S3F），并且通常受影响的转录本在DNA损伤、细胞周期和修复签名中富集（图S3G）。剪接交替基因在SF3B1抑制之间表现出广泛的重叠，SF3B1沉默，P5091处理。通常改变的转录本富含蛋白质脱乙酰化，G2-M相变和DDR途径（图S3、G和H）。我们还发现E7107治疗（或shSF3B1表达式）导致在典型3′剪接位点上游约64个核苷酸（nt）处使用一个隐性3′剪接位点[图S3，K和L，蓝线；64 nt（对数264=6）]。相反，突变细胞SF3B1在典型3′剪接位点上游15nt处有一个隐性的3′剪接位点，尿苷较少，嘌呤残基较多(8,44)，表明SF3B1消声和SF3B1A3SS剪接突变。这些数据表明，SF3B1的沉默或抑制导致外显子的广泛跳过和3′剪接位点的隐匿性改变。图3DNA损伤反应转录本对SF3B1水平的扰动敏感。(A)E7107诱导的CUTL1细胞剪接改变的表现。错误发现率（FDR）<0.05和剪接百分比（PSI）<0.1（某一特定基因的转录本有10%受到影响）的事件被呈现。选择性剪接事件分为五类：跳过外显子（SE）、保留内含子（RI）、互斥外显子（MXE）、选择性5′剪接位点（A5SS）和备选3′剪接位点（A3SS）。(B)重叠的选择性剪接转录本(n=1636），在SF3B1消声后(shSF3B1#1/2)抑制作用（3nM E7107，24小时）(P<0.001）。(C)（B）中转录集的基因本体分析。(D)用1.5和3nM E7107处理CUTL1细胞后基因表达变化的κ-均值聚类分析。(E)（D）中两个基因簇的基因本体分析。(F)E7107处理（1.5和3nM，24小时，CUTL1细胞）后基因表达改变的主要DNA损伤反应（DDR）基因（顶部）。E7107处理（1.5nm，24小时，Cuttl1细胞）诱导基因表达折叠变化的瀑布图。红点代表DDR转录本。(G)3nme7107（24小时）与载体的选择性剪接（AS）基因重叠，3nme7107（24小时）与载体Dn调控基因的重叠。(H)E7107加NMD抑制剂（NMDi）联合治疗后基因表达变化的热图（E7107治疗下调的转录本显示，调整P<0.01）。(我)E7107+NMDi与E7107联合治疗上调基因的基因本体分析。为了研究SF3B1抑制对转录的影响，我们对转录组的变化进行了κ-均值聚类分析SF3B1以E7107的剂量依赖性抑制并鉴定其对转录的积极和消极影响(图3D和表S4）。RNA代谢过程在正调控基因簇中富集(图3E)与此相反，DDR相关的途径在受到负面影响的集群中更为丰富(图3E)对SF3B1抑制作用最显著的基因家族是DDR，共有44个受影响的转录本，包括法国航空航天局,自动取款机,自动条码读取器,雷达51，和支票2提示SF3B1可能在DDR调节中发挥作用(图3F)一。SF3B1沉默导致了类似的结论（图S4，A到F和表S5），在E7107和shSF3B1（图S4、G和H）。最后，DDR转录物的表达通常受到E7107治疗和SF3B1消声（图S4I）。以上结果提示SF3B1可能影响转录水平。我们的分析显示E710的剪接模式也发生了显著的改变(图3G)过去的研究表明，由于SF3B1突变或抑制引起的异常剪接后，转录和剪接在功能上是相互交织的(8,45,46)以及SF3B1和其他剪接因子在转录活性中的潜在作用(14–16,47)为了探讨SF3B1抑制在NMD转录降解中的作用，我们评估了E7107和NMD抑制剂（NMDi）处理后的基因表达和剪接变化，以阻断SMG5与NMD中的主要腺苷三磷酸酶（ATP酶）和螺旋酶（UPF1）之间的相互作用(48,49)并与单药治疗效果进行比较。我们观察到E7107介导的基因表达下调对NMD抑制的显著挽救（4535个转录本中有1722个被挽救；图3H)富集分析显示DDR基因家族成员的表达，包括支票2,雷达51，和FANCD2经NMDi治疗后获救(图3，H和I)表明SF3B1抑制部分通过NMD降解降低DDR转录水平。我们的发现提示SF3B1在控制DDR转录水平中起作用，并使我们推测SF3B1与DDR途径有关。我们对SF3B1抑制或沉默进行彗星实验，以确定SF3B1对DNA损伤的影响。组蛋白H2AX磷酸化（γH2AX）水平（双链断裂标记物）和彗星尾长度（DNA损伤的替代物）在E7107治疗或SF3B1沉默(图4，A至C，以及图S5，A至D）。这些发现表明，SF3B1沉默或抑制引起T-ALL细胞DNA损伤的显著积累。图4.SF3B1活性对CHEK2水平和DNA损伤反应至关重要。(A)3nM E7107处理24小时后Cuttl1和JURKAT细胞的γH2AX水平。(B和C)用3nM E7107处理24或48小时的Cuttl1细胞的代表性彗星分析照片[右侧面板中（C）的量化，n=45]**P≤0.01。(D)3nM E7107处理24小时CUTLL1转录起始位点周围MapR信号的亚基因分析。二甲基亚砜。(E)标准化瞬时转录组测序（TT-seq）的亚基因分析读取蛋白质编码转录物（±3-kb面积，3nm E7107，15分钟）。(F)E7107中剪接变化与载体的散射图（FDR<0.05和PSI>0.1）。(G)代表外显子-外显子连接的刺身图支票2用E7107（3nm，24小时）处理Cuttl1细胞。(H和我)PCR检测支票2外显子7/9跳入shSF3B1切割1细胞（H）或用3nM E7107处理[24小时，（I）]。(J)CHEK2蛋白水平shSF3B1Cuttl1细胞或用E7107（1.5和3nM）处理24小时。(K)聚合酶链反应检测CHEK2外显子7/9跳跃舒普夫1用E7107处理的Cuttl1细胞（3nM，24小时）和3nM E7107或3nM E7107+CHX（50μg/ml）处理8小时（w e，带外显子）。(我)增长嘘嘘。1-以及嘘嘘。2-表达CUTL1细胞(n=3）。(米)CHEK2蛋白水平shSF3B1用多西环素（Dox；1.5μg/ml，48h）处理CUTLL1细胞，诱导CHEK2异位表达。在过去的十年里SF3B1，和其他剪接因子基因，已经被证明是通过R-环的积累而损害基因组完整性的(10,11,50–54)R环由DNA/RNA杂交体和单个DNA链组成，可能干扰DNA的复制、修复和转录；它们在转录活跃的部位暂时形成，如果不解决，可以诱导dsb和DNA损伤，从而暂停DNA完整性、染色质结构和细胞增殖的风险(55–58)为了分析R环对SF3B1的抑制作用，我们采用MapR方法，即利用催化突变核糖核酸酶（RNase）H在不切割RNA链的情况下引导微球菌核酸酶进入R环；随后分离出R环，并通过高通量测序对其进行表征(59)我们的研究表明SF3B124小时的抑制会导致基因组中R-环分布的变化，并导致R-环的整体减少（E7107条件下为12568个峰，而溶媒中为17303个峰；图4D以及图S5E）。这一发现表明，R环的变化不能解释治疗后24小时内观察到的DDR表型，而且这两种现象在时间和空间上是不耦合的。由于转录和剪接的同时发生以及SF3B1抑制对R环形成的影响，我们接下来通过绘制新生转录物和执行瞬时转录组测序（TT-seq）来研究SF3B1抑制对活性转录的影响(60)，作为活性转录的指标，在E7107药物治疗15分钟后。我们的分析显示剪接抑制导致转录延伸受损(图4E)E7107处理15分钟后，效果在E7107处理24小时后增强（图S5F）。转录受损可能是R环数量减少的原因。此外，受影响的转录本呈现R环变化，这表明SF3B1介导的新生转录减少和R环减少之间存在联系。CHEK2是T-ALL中SF3B1的重要靶点为了研究SF3B1抑制在DNA损伤中的作用，我们分析了E7107治疗后DDR相关转录物剪接模式潜在变化的测序数据。我们鉴定了一般转录因子ⅡH亚单位1和2c的剪接变化(GTF2H1和GTF2H2C)范科尼贫血a、g组(法国航空航天局和FANCG公司)以及检查点激酶1和2(支票1和支票2) (图4F以及图S5G）。细胞周期相关转录支票2编码CHEK2激酶结构域的DDR转录本，在E7107治疗外显子跳跃（第7外显子和第9外显子，PSI-SE）时，其PSI（剪接百分比）得分最高7=0.719，磅/平方英寸9=0.739；图4G)ATM中的CHEK2通路被认为是由dsk2介导的(61)一。自动取款机转录也受SE现象的影响，尽管与CHEK2相比，其影响程度较低（PSI-SE=0.57；图4F)表明CHEK2是通过剪接影响SF3B1抑制的主要途径成分。虽然已经确认支票2突变提示CHEK2是多种癌症的候选抑癌因子，如乳腺癌(62,63)，最近的证据显示支票2也可能作为一个癌基因影响化疗的反应(64,65)而检查点激酶抑制剂已显示出作为治疗药物的前景(66,67)我们确认了外显子在支票2抑制或沉默的转录本SF3B1通过聚合酶链反应（PCR）(图4、H和I，以及图S5H）。我们的附加分析显示支票2T-ALL细胞与T细胞的mRNA表达比较（图S5I）。支票2丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶调节G2-M期检查点对DNA损伤的反应(68)跳过外显子7或9可能通过提前终止密码子和NMD途径导致CHEK2转录和蛋白质水平的降低(图4J以及图S5，J至N）。进一步评估支票2通过NMD，我们沉默了NMD的主要成分atp酶和解旋酶UPF1(69,70)或用CHX处理细胞，阻断NMD（图S5O）。两者兼而有之舒普夫1CHX治疗部分恢复了支票2SE 7或SE 9的转录本(图4K)，暗示潜在的调节支票2通过NMD，与我们先前在图3I.为了研究CHEK2在T-ALL中的作用，我们沉默了支票2(嘘嘘)观察DNA损伤和凋亡的增加（图S6，A和B）和增殖减少，通过G2-M逮捕(图4L和图S6C）(71)使用CHEK2抑制剂（BML277）导致细胞生长、凋亡和G2-M逮捕类似于嘘嘘（图S5，D至F）。诱导异位表达CHEK2部分挽救了SF3B1引起的DNA损伤(图4M)，表明支票2是SF3B1的关键目标。总之，我们的结果表明，阻断SF3B1会导致支票2外显子9跳过，最终导致G2-M阻滞和凋亡。一种基于剪接的靶向T细胞白血病细胞的联合用药方法抗DNA损伤化疗是T-ALL未得到满足的主要需求。由于HR T-ALL样本中SF3B1的高蛋白水平和E7107引起DDR的改变，我们使用剪接因子抑制剂和化疗药物（如拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和米托蒽醌作为单剂治疗或联合E7107来评估生长抑制(图5，A至D，以及图S7，A至D）。E7107与化疗药物（阿霉素除外）协同阻断T-ALL生长。用临床剪接抑制剂H3B-8800进行治疗产生了几乎相同的结果（图S7，E到N）。SF3B1沉默使T-ALL细胞系对化疗药物的敏感性高于对照细胞，证实了SF3B1对化疗反应的影响(图5、E和F，以及图S7，O和P）。联合药物治疗后γH2AX水平的增加进一步表明SF3B1沉默和T-ALL化疗之间的协同作用（图S7Q）。图5一种基于剪接的组合药物治疗急性淋巴细胞白血病。(A到D)代表E7107与米托蒽醌、喜树碱、拓扑替康和依托泊苷联合治疗的协同热图（CUTLL1，3天）。HSA，最高的单一探员。红色表示药物协同作用。(E和F)集成电路50处理后的曲线控制和shSF3B1#2用米托蒽醌和喜树碱切割细胞。(G和H)代表E7107与BML277或SCH900776联合治疗的协同热图（CUTLL1，3天）。红色表示药物协同作用。(我)2 nM E7107、50μM BML277或2 nM E7107+50μM BML277处理24小时后的代表性细胞活性。(J)表达荧光素酶的CUTL1细胞通过尾静脉注射到免疫受损小鼠体内，并与E7107（每天5 mg/kg）、BML277（每天1 mg/kg）或E7107和BML277（“Comb”）处理的小鼠相连接。采用生物发光和活体成像系统设备，每周两次通过小鼠体内的blast检测评估白血病负荷。第21天和第11天的发光强度在小鼠右侧和第11天的发光强度变化具有代表性(n=5），E7107(n=7），BML277(n=7），或E7107和BML277(n=7)]. **P≤0.01。(K)小鼠存活分析（I）【载具】(n=5），E7107(n=7），BML277(n=7），或E7107和BML277(n=7）]。然后我们测试了E7107和CHEK2抑制剂（BML277）的组合(72,73)在T-ALL细胞系中发现这两种化合物具有很高的协同作用(图5G).SCH900776诱导CHEK1的抑制，CHEK1是一种结构类似于CHEK2的激酶(74)，也显示出与E7107的协同作用(图5H).E7107和CHEK2的协同作用得分在所有被测小分子中最高(图5H)为了在更具生理相关性的环境中测试这种药物组合，我们使用E7107和CHEK2抑制剂治疗患者样本。我们观察到对病人样本生存能力有很强的抑制作用(图5I)类似于先前测试过的人类细胞系。这促使我们在临床前T-ALL模型中进一步测试这种药物组合。我们将表达荧光素酶的CUTL1细胞移植到免疫功能低下的小鼠体内，然后用E7107和BML277作为单药或联合用药治疗肿瘤。与单一治疗相比，联合用药的小鼠肿瘤进一步消退，与延长小鼠存活时间有关(图5，J和K)我们的分析未能检测到与体重或器官重量、血细胞数量、杯状细胞化生或其他胃肠道毒性相关的显著毒性，例如先前证明的用于阻断T-ALL治疗中NOTCH1活性的γ分泌酶抑制剂药物（图S8，A至E和表S1）(34)一。总的来说，我们的数据表明剪接抑制与表观遗传和转录抑制以及化疗药物对T-ALL细胞的生长具有很强的协同作用，并且没有明显的毒性，显示了针对T-ALL剪接体的治疗潜力。讨论尽管SF3B1是成人癌症中最常见的突变剪接因子之一，但儿童肿瘤，如T-ALL，表现出很少的剪接突变(26)然而，T-ALL表现出异常的剪接和对SF3B1抑制的敏感性。我们目前的研究通过USP7活性和防止降解来确定U2组分SF3B1在儿童白血病中的调节机制。进一步的研究有助于确定SF3B1的降解途径，揭示泛素化和其他翻译后修饰在控制SF3B1水平和活性方面的潜在相互作用。在我们观察到SF3B1抑制导致基因组中R环减少的驱动下，我们将白血病中新生转录组的变化映射到SF3B1抑制上。我们的分子发现，结合生化研究的结果，表明SF3B1在癌基因的转录和DDR转录中起着关键作用。考虑到剪接调控在表达高水平转录放大器MYC的肿瘤中的重要性(20)，我们认为我们的发现可能通过SF3B1参与主动转录来解释这种依赖性。在HR肿瘤中，SF3B1水平升高，新一代剪接抑制剂在临床上表现出最小的毒性(75)提示高SF3B1水平与治疗耐药有关，可能在治疗反应中有重要意义。剪接抑制剂作为单一药物在临床上的应用已显示出前景，新一代化合物H3B-8800在一期研究中被证明是足够安全的(30,75)然而，用H3B-8800治疗的髓系恶性肿瘤患者血液学有所改善，但无部分或完全缓解。在我们的研究中，我们证明了SF3B1抑制剂在患者样本、小鼠和异种移植T-ALL临床前模型中的有效性。我们进一步证实，SF3B1抑制会影响一个新的外显子跳跃事件，并最终影响支票2我们还展示了CHEK2作为SF3B1下游DDR的关键调控因子对SF3B1抑制的重要性。以前的研究已经证明了突变U2AF1细胞中R环形成的增加，以及对ATR激酶抑制剂的敏感性对SF3B1的抑制作用(76)进一步研究SF3B1在剪接体野生型和突变型肿瘤中R环形成和DDR的抑制作用。我们的研究表明CHEK2是SF3B1的一个重要靶点，CHEK2的异位表达显示了SF3B1抑制剂与CHEK2抑制剂以及化疗药物的高度协同作用，并提出SF3B1抑制剂E7107是一种能使癌细胞对化疗敏感的先导化合物。鉴于SF3B1和CHEK2的抑制作用及其组合对造血祖细胞和临床前模型具有非常低的毒性[我们目前的研究和(26)]基于剪接的药物组合是提高治疗效果和克服T-ALL耐药性的潜在策略，且无明显相关毒性。方法细胞系和原代细胞人T-ALL细胞系Cuttl1（哥伦比亚大学A.Ferrando的礼物）和JURKAT[美国类型培养集（ATCC），马纳萨斯，弗吉尼亚州，#CCL-119]培养在RPMI 1640培养基中，添加10%热灭活胎牛血清（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO），1%青霉素/链霉素（吉布科，Thermo Fisher Scientific，NH汉普顿）和1%谷氨酰胺（Gibco，Thermo Fisher Scientific）。293T细胞（ATCC，#CRL-11268）在Dulbecco改良的Eagle's培养基中培养，培养液中添加10%热灭活FBS、1%青霉素/链霉素和1%谷氨酰胺。使用Lonza Walkersville MycoAlert支原体检测试剂盒定期检测细胞是否存在支原体。细胞系已通过短串联重复序列分析（JURKAT）或PCR检测TCRb-NOTCH1易位（TCRBJ2S4CUTLL1F:5′-GGACCGCTCTCAGTGCT-3′，NOTCH1CUTTL1R:5′-TCCCGCTCAAATAGG-3′）。人CD3+，CD8+，和CD4+T细胞购自所有细胞。通用域名格式（加利福尼亚州阿拉米达市）或阿斯塔特生物制品公司（华盛顿州博瑟尔市）。原始人类样本由合作机构在知情同意的情况下采集，并在帕多瓦大学机构审查委员会、意大利肿瘤协会和柏林-法兰克福-明斯特（AIEOP-BFM）的监督下进行分析，所有2000/2006儿科临床试验都是如此。根据赫尔辛基宣言，在试验进入时从患者处获得使用剩余材料用于研究目的的知情同意。用α-MEM培养基[10%人热灭活AB+血清、10